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间接流式细胞仪方案

时间 :2018-12-21 来源:百购生物网

间接流式细胞仪方案

使用一抗和缀合的二抗的流式细胞术的一般程序。 
间接标记需要两个孵育步骤,首先是一抗,然后是相容的二抗。次级(而非初级)抗体具有缀合的荧光染料(FITC,PE,Cy5®等)。请注意,这是一般协议,您可能需要根据您的应用进行调整。

一般程序:

  1. 收获并洗涤细胞然后确定总细胞数。

    细胞通常在聚苯乙烯圆底12×75mm 2 Falcon管中染色但是,它们可以在任何有适当离心机的容器中染色,例如试管,eppendorf管和96孔圆底微量滴定板。一般来说,细胞应该足够硬地旋转,以便可以在几乎没有细胞损失的情况下去除上清液,但不要太难以使细胞难以重悬。

    检查细胞的存活率总是有用的,其应该是约95%且不低于90%。
  2. 在冰冷的PBS,10%FCS,1%叠氮化钠中将细胞重悬至约1-5×10 6个细胞/ ml。



    使用冰冷的试剂/溶液,并将细胞保持在4°C,因为低温和叠氮化钠的存在可以防止表面抗原的调节和内化,从而导致荧光强度的损失。


  3. 向每个管中加入100μl细胞悬浮液。
  4. 加入0.1-10μg/ ml的一抗。如有必要,稀释液应在3%BSA / PBS中进行。
  5. 在室温下孵育至少30分钟或在黑暗中孵育4°C。
  6. 通过以400g离心5分钟洗涤细胞3次,并将它们重悬于冰冷的PBS中。您可能需要调整所用细胞类型的离心条件(力和时间)。
  7. 在最佳稀释度下(根据制造商的说明书)将荧光染料标记的第二抗体稀释在3%BSA / PBS中,然后将细胞重悬于该溶液中。
  8. 在室温4°C下孵育至少20-30分钟。这种孵化必须在黑暗中进行。
  9. 通过以400g离心5分钟洗涤细胞3次,并将其重悬于冰冷的PBS,3%BSA,1%叠氮化钠中。
  10. 将细胞悬浮液立即保存在4°C的黑暗中。
  11. 分析:为获得最佳结果,请尽快分析流式细胞仪上的细胞。

我们建议在同一天进行分析。为了延长储存时间(16小时)以及在细胞计数器上规划时间的更大灵活性,将细胞重悬于1%多聚甲醛中以防止变质。


固定方式:

如果您需要在分析前等待超过1小时,您可能需要在步骤5之后修复细胞。这可以将它们保存几天(这将稳定光散射并使大多数生物危害剂失活)。控制将需要使用相同的程序固定。如果细胞需要保持活力,则不应该固定细胞。有几种方法可供选择。对不同抗原的固定需要用户进行优化。

  1. 多聚甲醛0.01%至1%仅10-15分钟,每个样品100μl。
  2. 丙酮或甲醇:
     

N / B聚苯乙烯/塑料管不适合与丙酮一起使用

每个样品加入1ml冰冷的丙酮。
轻轻混合。置于-20°C保持5-10分钟。
离心,在PBS 1%BSA中洗涤两次。



如果您担心恢复细胞功能,请不要在缓冲液中加入叠氮化钠,例如,如果要收集细胞进行功能检测。它抑制代谢活动。