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流式细胞仪中电子元件的主要元件

时间 :2019-01-21 来源:百购生物网

探测器
固态探测器足以测量前向散射光。为了测量与激光束成直角的荧光和散射,使用光电倍增管。PMT的灵敏度取决于光的波长。对于用于检测600nm及以上波长的位置,选择红色敏感PMT。
信号处理
以下部分描述了电子设备如何处理来自探测器的信号。直到最近,在大多数仪器中使用传统的电子电路。在更现代的机器中,信号在早期阶段从模拟转换为数字,并且所有后续处理都以数字方式处理。数字处理有几个优点,尤其是准确性和速度。电子元件的主要元件如图2.12所示  。
流式细胞仪中电子元件的主要元件。ADC =模拟到数字转换器。
电子触发器
在(预)扩增后,来自光电倍增管的信号经历进一步处理。必须设置仪器以响应从感兴趣的粒子(例如,细胞)获得的信号,并忽略来自电子噪声的碎片和“尖峰”。在一个或可能两个参数上设置阈值水平,使得仅当信号上升到该水平以上时才检测到细胞。所选参数有时被称为鉴别器。通常使用光散射作为触发器。可以根据来自荧光染色的DNA触发仪器,但通常不应使用免疫荧光信号,因为可能无意中将负细胞排除在分析之外。
正确设置鉴别器很重要。设置不正确会导致信号被正确记录
更改鉴别器设置的效果。显示来自人外周血白细胞的侧向与前向光散射。鉴别器已设置为前向光散射。A.鉴别器设置得太低,允许记录残留的红细胞和碎片。B.鉴别器设置正确。C.鉴别器设置得太高。一些较小的细胞丢失了。 数据文件
脉冲处理
当细胞通过激光束时,它将产生一个信号脉冲,它具有一个高度(或峰值),宽度和一个积分区域(图2.14))。如果激光束的宽度大于细胞直径的宽度,则信号的峰值(或高度)将精确地反映细胞的总荧光。由于这更快更容易记录,因此通常会记录此参数。如果使用窄椭圆形光束,则在任何给定时间只能照射一部分单元。为了产生与细胞总荧光成比例的信号,脉冲被积分(脉冲区域)。还可以记录脉冲的宽度和峰值,这将给出关于通过光束的细胞长度的一些信息。该信息可用于DNA测量,以区分单细胞或细胞核和双峰。
来自前向光散射的脉冲宽度有时用于测量细胞通过激光束的“飞行时间”,并因此测量其长度。
当细胞通过激光束时产生的信号。
线性或对数数据显示
大多数细胞计数器提供荧光和光散射强度的线性和对数显示之间的选择。
对于细胞周期测量,使用DNA染色,应始终使用线性扩增。对于免疫荧光,对数扩增调节信号,使得弱信号和强信号都可以以相同的比例记录。更改为对数显示可以压缩积极事件的比例并扩大负面事件的比例。因此,通过眼睛,观察者对正面和负面事件之间的比率有更好的印象。当然,实际数字是相同的。
显示了使用荧光素标记的CD8抗体获得的人淋巴细胞数据。请注意,对于线性刻度,负面事件对y轴很难。必须降低y轴的比例以允许观察到阳性事件。一些积极事件太亮而无法容纳在x轴上并且是不规模的。
CD8在人淋巴细胞上的表达。使用线性和对数扩增记录数据。 数据文件
细胞分选
有两种使用流式细胞仪分选细胞的方法。最常用的方法是通过带电液滴的静电偏转。替代方法使用压电装置机械地分选细胞。